【一起读文献】 Biological Psychiatry：伏隔核的线粒体蛋白MFN2调节焦虑和抑郁样行为
导读:
越来越多的证据表明线粒体在精神疾病中至关重要的作用。然而，对在调节焦虑和抑郁神经回路中调控线粒体的分子以及它们如何影响神经元的结构和功能，我们知之甚少。近期在《Biological Psychiatry》（IF 12.095）期刊发表了题为“Mitofusin-2 in the Nucleus Accumbens Regulates Anxiety and Depression-like Behaviors Through Mitochondrial and Neuronal Actions”的研究论文，作者发现在脑内伏隔核中过表达MFN2可通过对线粒体和中刺状神经元结构和功能的作用对焦虑和抑郁样行为起调节作用，MFN2被认为是治疗焦虑和相关行为障碍的有前途的治疗靶点。
1. 高特质焦虑大鼠在抑郁症测试中表现出努力动机减弱
根据雄性大鼠在高架迷宫(EPM)开臂的停留时间进行分组(图1A)，分为高焦虑组(HA，≤5%开臂停留时间)或低焦虑组(LA，≥20%开臂停留时间)。每群大鼠约有8%的高焦虑大鼠和约20%的低焦虑大鼠。在新物体识别(NO)测试中，两组焦虑小鼠的探索行为也有所不同，HA大鼠嗅闻新物体的潜伏期更高，在中心停留的时间更少，并表现出更多欲接近新异物体的行为(图1B)。然而，在这些测试中大鼠总体活动距离没差异。(EPM:补充图1A; NO:补充图1B)。进一步对这两个测试的行为数据进行了Z评分(见补充信息)，证实了HA和LA大鼠在不同测试中焦虑样行为的一致性(图1C)。在糖水偏好实验中，HA大鼠表现出比LA大鼠更低的糖水偏好(图1D)。在强迫游泳测试中，HA大鼠不动时间更长 (图1E)，这表明HA大鼠在逆境下被动应对反应增加，努力动机降低。这些结果表明，当在远交Wistar大鼠中观察到特质焦虑时，HA大鼠会表现出与抑郁有关的动机缺陷。
表1. 不同特质焦虑的大鼠中观察到不同的行为和累积神经元表型
2. 在高特质焦虑大鼠伏隔核的中型棘突神经元中发现树突的复杂性和连接性降低
为了探索特质焦虑的差异是否与伏隔核的MSN的结构和功能的差异相关，对HA和LA大鼠的快速脑片伏隔核MSN进行了全细胞微小兴奋性突触后电流记录。HA大鼠MSN表现出较低的兴奋性输入(图1F，中间图)。微小兴奋性突触后电流的峰值幅度没有差异(图1F，右图)，提示HA和LA大鼠之间存在类似的突触后反应。与电生理数据一致，从电生理记录中获得的充满生物素的MSN的共聚焦分析显示，与LA大鼠相比，HA大鼠MSN树突分支较少（图1G），总树突长度较短（图1H）棘突密度较低(图1L)。树突棘直径随神经元成熟而增大，并能反映突触强度。为了研究焦虑与树突棘成熟的关系，我们根据棘突头端的最大直径将树突棘分为两类(细长型棘突<0.45um和蘑菇型棘突>0.45um)。与LA大鼠相比，HA大鼠细长型棘突更多且蘑菇型棘突更少(图1L)。高尔基法染色进一步证实了HA大鼠MSN的树突萎缩(图1J)，包括比LA大鼠更短的树突长度(图1K)和更低棘突密度(图1L)。此外，HA组细长型棘突的相对丰度高于LA组，而蘑菇型棘突的相对丰度低于LA组(图1L，右图)。为研究此结构差异在大脑中是否普遍存在，进一步测量了两组大鼠基底外侧杏仁核的树突，发现两组大鼠树突结构和总树突长度并无明显差异(图S1C，D)。综上所述，HA大鼠树突分枝和棘突密度的减少，以及伏隔核MSN的兴奋性输入减少。
3.高特质焦虑大鼠伏隔核内线粒体-内质网接触减少
线粒体与树突成熟以及突触的形成和维持有关。先前研究证实HA大鼠伏隔核中线粒体功能受损(即呼吸减少，电子转移链I和II的蛋白含量减少，ATP[三磷酸腺苷]减少)。伏隔核中线粒体局部功能障碍降低了社会竞争力，而社会竞争力的降低是患抑郁症的行为风险因素之一。此实验中利用体外高分辨率呼吸测量仪证实了HA大鼠伏隔核的线粒体功能受损，表现为它们的复合体I活性和最大线粒体呼吸的降低(图2A) 。线粒体形态与功能紧密相关，对LA和HA大鼠的伏隔核进行了电子显微镜分析，以评估线粒体形态和细胞器间的相互作用 (图2B)。两组在线粒体总数上没有差异(图2C)，然而HA大鼠表现出更大的线粒体面积(图2D)和线粒体组织覆盖率(图2E)，其形态提示线粒体轻度肿胀。鉴于线粒体-内质网接触在线粒体功能和动力学以及钙稳态重要作用，我们分析了线粒体-内质网接触。发现HA大鼠的线粒体-内质网接触数明显低于LA大鼠(图2F)且HA大鼠表现出更多的线粒体-线粒体接触(图2G)。综上所述，这些结果表明HA和LA大鼠在伏隔核神经元的线粒体功能、形态及其与内质网相关参数上均存在差异。
图2.差异性状焦虑与不同的线粒体功能有关
4. 高特质焦虑大鼠伏隔核 MSN中MFN2水平降低
线粒体的形状及其与内质网的相互作用都受到参与线粒体动力学(即分裂和融合)的分子的调控。线粒体融合蛋白MFN2在与线粒体-内质网接触中起着重要的调控作用。我们假设HA大鼠的伏隔核MFN2减少，因此测量了伏隔核组织中Mfn2的mRNA水平，发现HA的Mfn2 mRNA表达低于LA大鼠(图3A)。两组大鼠的其他融合基因(即Mfn1, Opa1)(图3B,C)和裂变基因(即Drp1)(图3D)的相对表达水平并无明显差异。WB检测进一步证实HA大鼠伏隔核组织中MFN2蛋白表达低于LA大鼠(图3E;图S2A)， OPA1和DRP1蛋白在两组中表达水平无差异(图S2A-C)。
为了量化特定NAc细胞类型中Mfn2的水平研究者进行了RNAscope分析。先前的研究表明伏隔核壳部是焦虑、快感缺乏和被动应对回路中的关键区域。HA大鼠在伏隔核壳部D1和D2受体表达神经元中的Mfn2表达水平均低于LA大鼠(图3F, G)。免疫组织化学证实，MFN2蛋白在HA大鼠伏隔核壳部表达较低(图3H，I)，两组大鼠在大脑皮层以及杏仁核的中央和基底外侧区(图3I)中MFN2蛋白表达无差异。在伏隔核核部， HA大鼠两种细胞类型的Mfn2均略低于LA大鼠且均无显著性差异(图S2D,E)。此外，在缺乏D1和D2受体的细胞中，Mfn2在伏隔核核部和壳部的表达没有差异(图S2F)。这些结果支持伏隔核壳MSN 的Mfn2水平降低与HA之间的存在关联。
图3.差异特征性焦虑与不同的线粒体动力学学和MFN2的减少有关
5.在HA大鼠伏隔核中过表达MFN2可使线粒体参数和线粒体-内质网接触正常化
通过给HA大鼠伏隔核注射AAV病毒，使MFN2蛋白过表达(MFN2 OE)大鼠，试图通过调控伏隔核MFN2水平来使HA大鼠的细胞和行为恢复正常。将实施假手术的LA（LA-Sham）和HA大鼠（HA-Sham）和MFN2 OE大鼠三者的细胞和行为表型进行比较。与HA-Sham大鼠相比，MFN2 OE HA大鼠伏隔核中Mfn2的mRNA和蛋白表达显著增加(图4A，B；图S3A，B)，并使HA线粒体的呼吸能力恢复到LA-Sham大鼠的水平(图4C)。
接着检测了MFN2过表达（OE）对线粒体形态的影响(图4D)。结果显示线粒体密度不受焦虑和MFN2过表达的影响(图4E)，再次证实了焦虑与三组大鼠线粒体面积(图4F)和覆盖率(图4G)以及线粒体-内质网接触(图4H)的差异相关。值得注意的是，MFN2过表达减少了HA大鼠线粒体的面积(图4F)和覆盖率(图4G)，增加了线粒体与ER的接触(图4H)，从而使HA大鼠的线粒体特征恢复到LA大鼠的水平。为能准确地计算出单个线粒体的体积，对伏隔核壳部的线粒体网络进行了三维重建。研究者重建了8只大鼠的线粒体网络，结果显示HA大鼠线粒体总体积比LA大鼠更大，但可通过MFN2 OE使其正常化(图4I, L)。当单独分析树突区的线粒体时，HA大鼠线粒体总体积的增加更加显著(图4M，N)。且线粒体的数量和长度既不受焦虑的影响，也不受MFN2 OE的影响(图4K，L)。为证实线粒体功能和神经元形态的改变不是由AAV(腺相关病毒)转染引起的细胞免疫反应所致。将注射pAAV9-hSyn1-GFP-WPRE的大鼠与假手术大鼠相比，未发现线粒体呼吸、关键线粒体基因表达或神经元形态计量学参数的任何变化(图S4)。
图4. 在NAC中MFN2的过表达使线粒体功能正常化
6. 在HA大鼠伏隔核中过表达MFN2可使神经元和行为表型正常化
接下来探讨MFN2 OE对细胞和大鼠行为的影响。HA大鼠的伏隔核MSN的微小兴奋性突触后电流的频率降低（图1），但可通过过表达MFN2 使HA大鼠恢复到与LA大鼠相当的水平（图5A）。此外，MFN2 OE大鼠记录的电流平均峰值更小，这可能是由于新产生的突触的突触后反应减少所致。HA大鼠的MFN2能使HA大鼠较差的树突分枝和棘突形态恢复到LA大鼠的水平。这与从电生理记录中获得的充满生物素的MSN的共聚焦分析(图5B-D)和MSN高尔基染色(图5E,F)结果一致。
伏隔核中过表达MFN2可降低HA动物焦虑和抑郁相关行为测量，并达到与LA大鼠相当的水平。MFN2 OE大鼠在高架迷宫的开臂停留的时间比HA大鼠更长(图5G)，表明过表达MFN2有缓解焦虑的类似作用。MFN2 OE大鼠比HA大鼠表现出更强的糖水偏好(图5H)，且在强迫游泳试验中不动的时间更短(图5I)，表明过表达MFN2有缓解抑郁的作用。这些结果提示伏隔核MSN中Mfn2的表达水平与焦虑相关的线粒体、神经元和大鼠行为学表型之间存在关联。
结 论
综上所述， MFN2介导的线粒体和神经元表型改变在调节焦虑和动机行为方面起着至关重要的作用。高焦虑动物表现出抑郁样行为增加，伏隔核的线粒体GTP酶 Mfn2表达降低，同时线粒体(即呼吸、体积、与内质网的相互作用)和中型棘突神经元（即树突复杂性、树棘突密度和类型、兴奋性输入)也发生了变化。MFN2在伏隔核中的过表达可逆转线粒体和神经元的表型的改变及HA大鼠焦虑和抑郁样行为，MFN2是治疗焦虑和相关行为障碍的潜在新靶点。
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Gebara E, Zanoletti O, Ghosal S, Grosse J, Schneider BL, Knott G, Astori S, Sandi C. Mitofusin-2 in the Nucleus Accumbens Regulates Anxiety and Depression-like Behaviors Through Mitochondrial and Neuronal Actions. Biol Psychiatry. 2020 Dec 8:S0006-3223(20)32110-7. doi: 10.1016/j.biopsych.2020.12.003. Epub ahead of print. PMID: 33583561.
校 审 / 梁 春 梅
小崔和他的小伙伴们